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DAP-seq技術(shù)助力揭示MdBPC2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控蘋(píng)果生長(zhǎng)素的生物合成

更新時(shí)間:2024-01-24      點(diǎn)擊次數(shù):885

植物生長(zhǎng)素(IAA在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用。其化學(xué)本質(zhì)是吲哚乙酸。主要作用是使植物細(xì)胞壁松弛,從而使細(xì)胞生長(zhǎng)伸長(zhǎng),在許多植物中還能增加RNA和蛋白質(zhì)的合成。

目前BARLEY B RECOMBINANT/BASIC PENTACYSTEINE (BBR/BPC) 轉(zhuǎn)錄因子家族在擬南和水稻中已被證實(shí)能促進(jìn)誘導(dǎo)植物矮化(Sazuka et al. 2009; Li et al. 2008Monfared et al. 2011; Simonini et al. 2012; Petrella et al. 2020),然而在蘋(píng)果中,BPC轉(zhuǎn)錄因子影響植物結(jié)構(gòu)的確切機(jī)制尚不清楚

20231129日,西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院的李明軍教授課題組的研究成果,發(fā)表在The Plant cell期刊上(IF=11.6,文章題目是“The transcription factor MdBPC2 alters apple growth and promotes dwarfing by regulating auxin biosynthesis"。該研究使用DNA親和測(cè)序(DAP-seq)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)鑒定及揭示了BBR/BPC家族的MdBPC2轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控蘋(píng)果生長(zhǎng)素生物合成,從而協(xié)調(diào)蘋(píng)果的生長(zhǎng)和植株結(jié)構(gòu)的機(jī)制。

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本研究發(fā)現(xiàn)MdBPC2轉(zhuǎn)錄因子在矮稈砧木中的表達(dá)高于標(biāo)準(zhǔn)砧木。MdBPC2與PcG蛋白MdLHP1a/b相互作用,負(fù)向調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的生物合成。在過(guò)表達(dá)MdBPC2的轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果植株中,抑制MdYUC2a和MdYUC6b基因?qū)е律L(zhǎng)素積累減少,植株生長(zhǎng)受到抑制,樹(shù)形結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。外源生長(zhǎng)素的補(bǔ)充恢復(fù)了這些轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果植株的高度、葉片形態(tài)和根系發(fā)育。在WT植株中,抗生長(zhǎng)素對(duì)氯苯氧異丁酸(PCIB)處理抑制了生長(zhǎng)素的生物合成,導(dǎo)致與MdBPC2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果植株相似的表型。最終揭示了MdBPC2如何通過(guò)H3K27me3修飾調(diào)控生長(zhǎng)素的生物合成以協(xié)調(diào)蘋(píng)果的生長(zhǎng)和植株結(jié)構(gòu)的機(jī)制。

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1.MdBPC2在矮稈砧木中的表達(dá)及特性研究。

作者首先在蘋(píng)果中鑒定出6個(gè)MdBPC候選基因,并在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中分為2類(lèi)MdBPC1MdBPC2序列高度相似,屬于一類(lèi)MdBPC3MdBPC4MdBPC5MdBPC6屬于二類(lèi)。為確定MdBPC是否具有調(diào)控植物生長(zhǎng)的作用,比較了6個(gè)MdBPC基因在5個(gè)矮化砧木和5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)砧木中的表達(dá)譜。I類(lèi)BPCs的表達(dá)水平,尤其是MdBPC2在矮稈砧木中的表達(dá)水平顯著高于標(biāo)準(zhǔn)砧木。因此,最終選擇MdBPC2作為進(jìn)一步研究的候選基因。

利用定量PCR (qPCR)研究了MdBPC2基因在不同組織中的表達(dá)譜。結(jié)果表明,MdBPC2在整個(gè)植物中廣泛表達(dá),其中莖尖表達(dá)量較高。為確定MdBPC2的亞細(xì)胞定位,瞬間表達(dá)了MdBPC2-GFP融合蛋白,表明了MdBPC2在細(xì)胞核中起作用。通過(guò)酵母雜交實(shí)驗(yàn),表明MdBPC2沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活活性,提示MdBPC2可能是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子。利用熒光素酶(luciferase, LUC)報(bào)告系統(tǒng)分析了其在植物中的轉(zhuǎn)錄活性,結(jié)果表明MdBPC2具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。

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2.       過(guò)表達(dá)MdBPC2和RNAi轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果株系的鑒定及其對(duì)植株生長(zhǎng)的影響。

作者構(gòu)建了過(guò)表達(dá)和RNA干擾(RNAi)載體,并將其轉(zhuǎn)化為蘋(píng)果品種GL3。PCR分析得到3個(gè)過(guò)表達(dá)系(MdBPC2-OE1/3/4)和3個(gè)RNAi系(MdBPC2-RNAi3/5/6)。反轉(zhuǎn)錄定量PCR (RT-qPCR)分析顯示,與WT植株相比,轉(zhuǎn)基因MdBPC2-oe1/3/4植株的MdBPC2轉(zhuǎn)錄本約高15倍,轉(zhuǎn)基因MdBPC2-RNAi3 /5/6植株的MdBPC2轉(zhuǎn)錄本約低60%。之后還測(cè)量了MdBPC2轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果植株中其他5個(gè)MdBPC基因的表達(dá)水平。在MdBPC2沉默系中,MdBPC1的轉(zhuǎn)錄水平也受到抑制,可能是由于序列相似性較高。在MdBPC2過(guò)表達(dá)系中,植株生長(zhǎng)明顯受到抑制。MdBPC2過(guò)表達(dá)顯著降低了植株的平均株高,僅為WT植株的29%。葉片形態(tài)也發(fā)生了變化,長(zhǎng)寬比減小,形狀更圓。此外,過(guò)表達(dá)植株根系發(fā)育不發(fā)達(dá),根長(zhǎng)縮短,側(cè)根數(shù)量減少。然而,在MDBPC2沉默系中,沒(méi)有明顯的表型變化,這可能是由于BPC家族成員之間的功能冗余。

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3.       MdBPC2改變生長(zhǎng)素含量

植物激素調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育,內(nèi)源激素含量或平衡的改變可能導(dǎo)致植物矮化。因此,作者在轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)系和RNA沉默系中測(cè)量了生長(zhǎng)素(IAA)、細(xì)胞分裂素(CTK)GA和油菜素內(nèi)酯(BR)等激素含量。與WT相比,CTKGABR的含量沒(méi)有變化,而MdBPC2過(guò)表達(dá)系的IAA含量顯著降低。為進(jìn)一步確定MdBPC2-OE表型是否由IAA缺乏引起,作者用外源IAA處理了MdBPC2-OE轉(zhuǎn)基因植株,外源施用IAA能以劑量依賴(lài)的方式恢復(fù)MdBPC2-OE植株的株高、葉片發(fā)育和根系生長(zhǎng)。重要的是,IAA促進(jìn)了MdBPC2-OE植株的生長(zhǎng),而WT植株的表型不受IAA處理的影響。這表明MdBPC2-OE植株對(duì)IAA濃度高度敏感。之后增加抑制生長(zhǎng)素作用的PCIB濃度處理WT植株,植株高度降低,葉片形態(tài)改變,側(cè)根數(shù)量顯著減少,且呈劑量依賴(lài)性。結(jié)果表明,MdBPC2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)源生長(zhǎng)素含量降低,從而抑制轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)。

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4.       MdBPC2直接靶點(diǎn)的鑒定

為確定MdBPC2過(guò)表達(dá)如何改變內(nèi)源IAA積累,作者使用WTMdBPC2-OE1/3/4植株的莖尖進(jìn)行了RNA測(cè)序(RNA-seq)。鑒定出433個(gè)上調(diào)基因和587個(gè)下調(diào)基因(WT相比)。已知參與生長(zhǎng)素合成和分解代謝的基因與MdBPC2-OE轉(zhuǎn)基因品系的1020個(gè)基因進(jìn)行比較,共發(fā)現(xiàn)3個(gè)重疊基因,分別是MdYUC2aMdYUC6b以及MdGH3.1a,并且在3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)下調(diào)。為了驗(yàn)證RNA-seq表達(dá)譜數(shù)據(jù),通過(guò)qRT-PCR分析了這3個(gè)基因,發(fā)現(xiàn)表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致,這也說(shuō)明了RNA-seq技術(shù)的準(zhǔn)確性。

DNA親和純化測(cè)序(DAP-seq)是一種通過(guò)分析基因組DNA與體外表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來(lái)篩選轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的高通量方法。與染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP-seq)相比,具有具有不受抗體和物種限制的優(yōu)點(diǎn),是一種高通量方法。因此,作者使用DAP-seq來(lái)揭示MdBPC2的全基因組結(jié)合位點(diǎn),分離所有MdBPC2結(jié)合DNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析。“GAGAGAGAGAGAG"這個(gè)富含GAGA的核苷酸序列比擬南BPC1結(jié)合位點(diǎn)更為保守。另外5個(gè)MdBPC2潛在結(jié)合位點(diǎn)也高度富集。

電泳遷移率轉(zhuǎn)移試驗(yàn)(EMSA)驗(yàn)證DAP-seq結(jié)果的可靠性。當(dāng)使用標(biāo)記的富含GAGADNA探針時(shí),可以檢測(cè)到特異性DNA-MdBPC2蛋白復(fù)合物,當(dāng)添加缺乏生物素標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性探針時(shí),這種信號(hào)傳導(dǎo)減弱。這種特異性競(jìng)爭(zhēng)組合表明MdBPC2可以特異性識(shí)別富含GAGA的序列。結(jié)果表明,MdBPC2在轉(zhuǎn)錄水平上通過(guò)抑制MdYUC2aMdYUC6b抑制生長(zhǎng)素的生物合成。

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5.       MdBPC2抑制MdYUC2aMdYUC6b的轉(zhuǎn)錄

為確定MdBPC2是否直接影響MdYUC2aMdYUC6b的轉(zhuǎn)錄激活,作者在蘋(píng)果愈傷組織中瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中檢測(cè)ProMdYUC2a:LUCProMdYUC6b:LUC構(gòu)建體的生物發(fā)光信號(hào),結(jié)果表明,MdYUC2aMdYUC6b啟動(dòng)子區(qū)域中所有富GA元件都可以與MdBPC2蛋白結(jié)合。

ChIP-qPCR結(jié)果表明MdBPC2可以通過(guò)GA-富元件與MdYUC2aMdYUC6b啟動(dòng)子結(jié)合。這些結(jié)果表明,生長(zhǎng)素生物合成的關(guān)鍵基因MdYUC2aMdYUC6bMdBPC2的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn),其轉(zhuǎn)錄活性受到MdBPC2的抑制。

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6.       MdBPC2導(dǎo)抑制組蛋白三甲基化在H3K27位點(diǎn)的富集

翻譯后組蛋白修飾與基因轉(zhuǎn)錄的激活或抑制有關(guān)。組蛋白3賴(lài)氨酸27甲基化(H3K27me3)的全基因組研究發(fā)現(xiàn),表觀遺傳機(jī)制可以調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素相關(guān)基因。為檢測(cè)H3K27me3抑制標(biāo)記是否與MdBPC2對(duì)MdYUC2aMdYUC6b的抑制有關(guān),通過(guò)ChIP檢測(cè)MdBPC2過(guò)表達(dá)后H3K27me3抑制標(biāo)記在MdYUC2aMdYUC6b位點(diǎn)的潛在差異,結(jié)果表明MdBPC2在抑制MdYUC2aMdYUC6b表達(dá)的表觀遺傳修飾中起重要作用。

7.       BPC2蛋白與PcG亞基LHP1a/b物理相互作用

在植物中,抑制表觀遺傳修飾H3K27me3主要由PcG蛋白識(shí)別和催化。作者使用酵母雙雜交(Y2H)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試MdBPC2與抑制性表觀遺傳修飾相關(guān)蛋白的相互作用,包括MEDEDA (MEA)、CURLY (CLF)、SWINGER (SWN)、胚胎花2 (EMF2)、受精獨(dú)立胚乳(FIE)和LIKE異染色質(zhì)蛋白1 (LHP1)。研究結(jié)果表明,MdBPC2與MdLHP1a/b相互作用。通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)進(jìn)一步評(píng)估。通過(guò)共表達(dá)融合蛋白nYFP-LHP1a/b和cYFP-BPC2,能在煙草表皮細(xì)胞細(xì)胞核中重建YFP的活性,證明MdLHP1a/b與MdBPC2相互作用。這些結(jié)果表明,MdBPC2可以通過(guò)MdLHP1a/b募集PcG復(fù)合物到靶基因。

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8.       LHP1參與MdBPC2導(dǎo)的YUC2a/6b表達(dá)抑制

由于MdBPC2可以特異性結(jié)合GAGA序列,并且MdBPC2MdLHP1之間存在相互作用,作者假設(shè)MdLHP1MdBPC2誘導(dǎo)的MdYUC2aMdYUC6b表達(dá)抑制中起作用。為驗(yàn)證這一假設(shè),首先使用ChIP-qPCR檢測(cè)了MdYUC2aMdYUC6b位點(diǎn)富集的MdLHP1水平,結(jié)果顯示MdYUC2aMdYUC6b位點(diǎn)H3K27me3水平的變化是由MdLHP1引起的。

為驗(yàn)證MdLHP1MdYUC2aMdYUC6b啟動(dòng)子上的富集是否需要MdBPC2的結(jié)合,制作了4個(gè)轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果愈傷組織系,含有突變的富GA元素的轉(zhuǎn)基因品系與含有完整的富GA元素的轉(zhuǎn)基因品系相比,H3K27me3水平顯著降低。這些結(jié)果表明,靶啟動(dòng)子內(nèi)的MdBPC2結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于MdLHP1導(dǎo)的H3K27me3修飾是必需的。

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9.       MdLHP1調(diào)控生長(zhǎng)素生物合成基因

為證實(shí)MdLHP1參與了MdBPC2對(duì)生長(zhǎng)素水平的調(diào)節(jié)在蘋(píng)果愈傷組織中過(guò)表達(dá)MdBPC2,獲得了3個(gè)轉(zhuǎn)基因系MdBPC2-GFP-OE1/2/3。這些轉(zhuǎn)基因系的愈傷組織中MdYUC2aMdYUC6b的表達(dá)水平顯著降低,與轉(zhuǎn)基因植物中的觀察結(jié)果一致。

DR5是一種合成的生長(zhǎng)素反應(yīng)元件,含有許多ARF轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。因此,在DR5啟動(dòng)子控制下表達(dá)的報(bào)告基因活性可以反映植物內(nèi)源生長(zhǎng)素含量。利用合成的ProDR5:GUS構(gòu)建體分析了轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果愈傷組織MdBPC2-GFP-OE1/2/3的生長(zhǎng)素含量。如圖E所示,WT相比,MdBPC2-GFP-OE1/2/3GUS染色明顯降低。當(dāng)沉默MdLHP1時(shí),GUS活性恢復(fù)并且高于WT。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明MdLHP1參與了MdBPC2在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)生長(zhǎng)素生物合成的調(diào)節(jié)。

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小結(jié)

株高是農(nóng)作物和園藝作物最重要的農(nóng)藝性狀之一。它限制了植物各器官的空間排列,與產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)。植物高度受環(huán)境、植物激素代謝和信號(hào)通路的相互作用控制,轉(zhuǎn)錄因子在這些過(guò)程中發(fā)揮重要作用。雖然轉(zhuǎn)錄因子在植物高度調(diào)節(jié)中的重要性早已被提出,但它們?nèi)绾握{(diào)節(jié)植物矮化的潛在分子機(jī)制卻知之甚少。在本研究中,作者發(fā)現(xiàn)MdBPC2調(diào)控MdYUC2aMdYUC6b的轉(zhuǎn)錄,抑制生長(zhǎng)素的生物合成,從而調(diào)節(jié)植物結(jié)構(gòu)。揭示了多年生木本植物通過(guò)BPC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控生長(zhǎng)素合成的新機(jī)制,為優(yōu)化植物結(jié)構(gòu)和提高產(chǎn)量提供了新的思路。

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